1989 年，美国纽约州立大学的 Fields 和 Song 基于真核生物转录起始调控机制，创立了酵母双杂交系统（Yeast-hybrid system，Y2H）—— 这一直接在酵母细胞内研究蛋白质相互作用的遗传学新方法，凭借其独特的设计原理与高效的应用特性，迅速成为生命科学领域的核心研究工具。从细胞分裂调节、凋亡调控到信号通路转导，从癌症相关基因功能解析到基因表达调控元件研究，Y2H 持续催生多个热点方向的突破，其研究范围更从蛋白质 - 蛋白质相互作用，拓展至蛋白质与 DNA、RNA 及小分子的相互作用，为新功能分子的发现提供了强大支撑。

一、技术创立与核心原理：转录因子拆分介导的互作检测（一）创立基础：真核转录起始调控的机制启示

Y2H 的建立源于对真核生物基因转录起始过程的深刻认知 —— 基因转录激活需反式转录激活因子参与，酵母转录因子 GAL4 是典型代表。其结构具有两大功能独立的核心区域：一是 DNA 结合结构域（BD），负责特异性结合报告基因启动子；二是转录激活结构域（AD），负责招募转录复合物启动基因表达。仅有 BD 或 AD 单独存在时，无法激活报告基因，只有两者在空间上形成完整结构，才能启动转录。

（二）核心设计：诱饵 - 猎物的融合表达策略

基于 GAL4 的结构特性，Y2H 采用 “诱饵 - 猎物” 双载体系统设计：

构建 “诱饵载体”：将待测蛋白（诱饵蛋白）与 BD 融合，形成 bait-BD 融合蛋白，该蛋白可结合报告基因启动子，但缺乏激活转录的能力；

构建 “猎物载体”：将目标蛋白（猎物蛋白）与 AD 融合，形成 Prey-AD 融合蛋白，该蛋白具备转录激活潜能，但无法结合报告基因启动子；

互作介导的转录激活：当两种载体共转化酵母细胞后，若诱饵蛋白与猎物蛋白发生特异性相互作用，会通过互作牵引 BD 与 AD 在空间上靠近，重构形成功能完整的 GAL4 转录因子，进而激活酵母基因组中预设的报告基因（如 lacZ、HIS3）转录；

结果判定：通过观察报告基因的表达表型（如显色反应、营养缺陷培养基上的生长能力），即可判断待测分子间是否存在相互作用。

二、多元应用领域：催生多学科热点研究

Y2H 凭借体内检测、操作简便的优势，在多个研究方向展现出强大应用价值，成为热点研究的核心驱动力：

细胞分裂与凋亡调控：筛选细胞周期关键蛋白（如 Cyclin、CDK）的互作伴侣，解析细胞分裂时序调控机制；鉴定凋亡通路中 Bcl-2 家族蛋白的结合分子，阐明细胞凋亡的开关调控网络。

信号通路转导解析：捕获信号通路中受体、激酶、转录因子等组分的互作关系，还原信号从胞外到核内的传递链条。例如，筛选 MAPK 信号通路中 Raf 的互作蛋白，明确信号级联传递的中间节点。

癌症相关基因功能研究：以癌基因（如 MYC、RAS）或抑癌基因（如 p53、PTEN）的表达产物为诱饵，筛选互作蛋白，揭示癌症发生发展中关键蛋白的调控网络，为挖掘癌相关靶点提供依据。

基因表达调控研究：探究转录因子与其他调控蛋白、基因启动子区域（DNA）的相互作用，明确基因表达的开关机制；鉴定 RNA 结合蛋白与靶标 RNA 的结合关系，解析转录后调控网络。

蛋白特异性验证：验证不同蛋白亚型、突变体与靶蛋白的结合特异性，分析氨基酸突变对蛋白互作的影响，为蛋白功能结构研究提供直接证据。

三、研究范围扩展：从蛋白互作到多分子互作研究

Y2H 的核心优势在于其可拓展性，随着技术优化，研究范围已突破最初的蛋白质 - 蛋白质相互作用，实现多维度延伸：

蛋白质与 DNA 相互作用：通过改良系统（如酵母单杂交），将 DNA 片段与 BD 融合，筛选能结合该 DNA 的蛋白质（如转录因子），解析基因表达的顺式调控元件与反式作用因子的结合关系。

蛋白质与 RNA 相互作用：借助酵母三杂交系统，引入 RNA 分子作为 “桥梁”，介导 bait-BD 与 Prey-AD 的靠近，筛选 RNA 结合蛋白，揭示 RNA 代谢、信号传导中蛋白与 RNA 的调控关系。

蛋白质与小分子相互作用：通过在酵母细胞内引入小分子化合物，筛选能与该小分子结合的蛋白质，或研究小分子对已知蛋白互作的调控作用，为药物靶点发现与机制解析提供工具。

四、技术优势与大规模 PPI 研究的应用前景

Y2H 之所以能在大规模蛋白质相互作用（PPI）研究中具备普遍应用前景，核心源于其显著的技术优势：

真实反映体内互作：在活酵母细胞内进行检测，可模拟生理环境下蛋白质的折叠、修饰及互作状态，结果更贴近生物体内的真实情况。

表型与基因型紧密关联：报告基因的表达表型直接由蛋白互作（基因型关联特征）决定，检测结果直观、易判断，降低了结果解读的复杂性。

联用 Gateway 载体构建技术：与高效的 Gateway 同源重组技术结合，可快速构建海量诱饵与猎物表达载体，大幅提升实验效率，适配高通量、大规模 PPI 筛选需求。

操作简便且成本可控：无需复杂的蛋白纯化步骤，实验流程标准化，设备要求相对简单，适合普通实验室开展规模化研究。

总结与展望

酵母双杂交系统的创立，是生命科学研究中 “从机制认知到技术转化” 的经典案例。从基于 GAL4 转录因子的简单设计，到如今覆盖多分子互作的多元化系统，Y2H 始终以高效、精准的特性，推动着细胞调控机制、疾病相关网络、新功能分子等领域的研究突破。

未来，随着与 AI 辅助互作预测、高通量测序、单细胞技术的深度融合，Y2H 将在动态互作检测、特异性筛选优化等方面持续升级，进一步拓展在精准医疗、药物研发等领域的应用边界，为解析复杂生命网络、攻克重大疾病提供更坚实的技术支撑。