做过染一抗➕用染料探针染细胞器组合的免疫荧光，也做过染不同抗体的免疫荧光，不过个人最多只做过3个抗体，以两个抗体来举例吧～[黄金薯R] [蹲后续H]分享一下关于IF的protocol，以及双抗体免疫荧光的tips，如何有效避免串色❓ ✅protocol在图2文字部分，大家自行拿图； ✅如何有效避免串色❓ 🌟1、铺细胞别太密，且尽可能用大体积细胞 ➡️太密就导致一抗结合蛋白增多，更容易出现非特异性染色，且细胞太密拍摄效果很一般，一般6孔板满孔的细胞我会取1/8的量铺到带有爬片的12孔板里，大概12小时后，细胞密度就刚刚好。 ➡️用大体积细胞（例如HeLa），拍摄效果好，HEK细胞相对来说效果欠佳，若用非工具细胞，就无需考虑这个问题。 🌟2、核放在最后染 双抗体染色时可不用活细胞染核液（Hoechst），也就是不要最开始染核，放到最后封片时，用DAPI染，DAPI浓度不要过高，核很容易被染色，低浓度染色即可。 🌟3、支原体清除后再做IF（图4） 用状态好，未被污染的细胞去做IF，状态好的细胞伸展很开，染色效果也更好，若细胞支原体污染，可能会产生图4图5的现象，非特异性染色严重且去不掉，染核染抗体都会被染上乱七八糟的东西。 🌟4、一抗浓度的问题 ➡️双抗体染色若外转质粒，可染标签抗体，标签抗体更特异且使用浓度低，一般都在1：500左右； ➡️若染内源性蛋白，浓度可1：200，做之前记得看下抗体说明书该抗体是否可以做IF； ➡️4度过夜染效果更好，一抗可回收，负20保存，大概可用3次，根据抗体灵敏度决定使用次数； ➡️双抗体IF，一定要用不同抗性的，一个用鼠，一个用兔，最好不要双鼠or双兔。 🌟5、二抗 常温孵育1～2h，避光，避开同属性的二抗，洗一抗可用pbs，二抗可以用tbst，多加一些吐温。 🌟6、拍摄 封片后拍摄时，可以适当缩短激发光波长，使其没有交叉波长。 比较好的选择：绿光488，红光555。