这个比做线粒体膜电位略难一些，不过掌握染色方法基本一次也可以成功🏆 图中采用的是DCFH-DA标记🏷️ 详细protocol看图6图7，第一次要做阳性对照，染Rosup，条件：50ug/ml，37度孵育30min DCF的荧光是均匀且致密的，与其他荧光有明显差别，细胞若带GFP不要用DCF检测ROS，带mCherry或其他荧光可以检测！ 染色要注意几点： [一R]探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则整个背景都很绿。 [二R]尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外)，以减少各种可能的误差。 [三R]荧光酶标仪检测时须使用适合荧光检测的黑板或白板，与测荧光素酶报告基因的板子类似 [四R]该荧光很容易淬灭，在荧光显微镜下拍摄时，要快速拍摄，不要墨迹，不然很容易淬灭！如果荧光过强，被激发后可能1～2s就会被动淬灭！我每次先不打开激光，白光找视野，然后就快速打开荧光快速按下snap！ [五R]可以从低浓度开始使用，摸清楚最佳浓度，若DCFH-DA浓度为10mM，使用浓度可以在1：5000～1：2000范围内，不同的处理方式可能需要不同的浓度… [星R]如果处理条件明显的诱导ROS产生，最好采用低浓度，例如2uM～5uM，若高浓度使用可能会造成假阳性，所有的组别没有差异！ [星R]如果处理条件有诱导ROS产生，但是不是特别明显，再采用低浓度可能造成假阴性，之前我做一个💊，NAC（ROS抑制剂）抑制功能，但是未检测到ROS的产生，后面才知道是因为使用浓度太低了，用5uM去装载细胞，立马有了很明显的阳性结果[看R] [星R]如果想知道ROS的释放是否是重要的，可以采用ROS抑制剂：NAC处理细胞，检测是否会逆转造膜后的表型 [星R]NAC使用浓度：5mM提前处理5小时，然后加入目的处理条件，一起反应，到点收细胞即可 [星R]ROS的检测可以与PI共染（如图3所示），but不是同步的，ROS释放不代表细胞一定会嘎，而PI阳性的细胞，此时ROS早已释放到胞外检测不到了