导语：当ALK抑制剂让肺癌患者看到长期生存希望时，为何仍有超过半数患者在两年内复发？问题或许不在癌细胞本身，而在于它们周围的“邻居”——那些曾被认为“无辜”的基质细胞。最新研究揭示，这些“邻居”正通过双重信号通路暗中保护癌细胞，让靶向治疗功亏一篑。

图源：CMT

当前，以阿来替尼（alectinib）为代表的间变性淋巴瘤激酶（ALK）酪氨酸激酶抑制剂（TKI）已将EML4-ALK融合阳性非小细胞肺癌（NSCLC）患者的五年生存率提升至60%以上，成为精准肿瘤治疗的典范。然而，临床实践中仍有30%-40%的患者在治疗初期即表现出原发性耐药，而几乎所有获得性缓解的患者最终都会面临疾病进展的困境。既往研究虽已揭示多种耐药机制——包括ALK激酶域二次突变、EGFR或KRAS等旁路信号激活、上皮-间质转化（EMT）及组织学类型转化——但仍有相当一部分耐药病例无法用上述机制解释，提示存在未被阐明的关键因素。

近年来，肿瘤微环境（TME）在耐药中的作用日益受到重视。癌症相关成纤维细胞（CAFs）作为TME中最丰富的基质成分，可通过分泌生长因子、细胞因子及重塑细胞外基质（ECM）等方式影响肿瘤生物学行为。然而，现有研究多聚焦于可溶性因子的旁分泌作用，对细胞-细胞直接接触介导的近分泌信号缺乏系统性评估。更关键的是，CAFs与肿瘤细胞之间的交互对话具有高度动态性和复杂性，传统实验方法难以同步解析两种信号类型的贡献权重。

2025年12月，Science Signaling发表了一篇题为"Cancer-associated fibroblasts confer ALK inhibitor resistance in EML4-ALK–driven lung cancer by concurrent integrin and MET signaling"的文章，首次采用创新的细胞类型特异性蛋白质组学技术，同时追踪了CAFs来源的肝细胞生长因子（HGF）-MET旁分泌轴与纤维连接蛋白（FN1）-整合素β1（ITGB1）近分泌轴在ALK-TKI耐药中的协同作用。该研究不仅填补了领域空白，更提出了双重阻断的联合治疗策略，为克服CAFs介导的耐药提供了可直接转化的临床路径，其方法论创新对解析其他肿瘤类型的基质-上皮交互机制亦具有重要借鉴意义。

本研究是一项基于体外细胞模型与体内动物实验的转化医学研究，旨在系统阐明CAFs介导EML4-ALK阳性NSCLC细胞对ALK抑制剂耐药的分子机制，并评估联合阻断关键信号通路的体内疗效。研究团队首先建立了包含五种EML4-ALK融合阳性NSCLC细胞系（H3122、H2228、STE1、CUTO8、CUTO9）与四种成纤维细胞系（两种原代肺CAFs、正常肺成纤维细胞MRC5及永生化肺成纤维细胞Wi38-VA13）的多维度共培养体系，通过活细胞成像系统动态监测荧光标记肿瘤细胞的增殖活性。

实验设计包含三个递进层次：其一，比较肿瘤细胞单培养、成纤维细胞条件培养基（CM）处理及物理共培养三种模式对四种ALK抑制剂（克唑替尼、塞瑞替尼、布格替尼、阿来替尼）敏感性的影响，明确细胞接触依赖性信号的贡献；其二，采用细胞类型特异性氨基酸前体标记（CTAP）结合串联质量标签（TMT）的定量磷酸化与表达蛋白质组学技术，在单细胞分辨率下解析共培养体系中肿瘤细胞与CAFs各自的信号网络变化。该技术通过代谢酶（赖氨酸消旋酶Lyr与二氨基庚二酸脱羧酶Ddc）的工程化表达，实现d8-D-赖氨酸与二氨基庚二酸（DAP）在特定细胞类型的选择性掺入，配合TMT标记区分药物处理组与对照组，最终获得4359个磷酸化位点与4320个赖氨酸标记肽段的定量数据；其三，在体外实验明确MET与ITGB1信号轴的协同作用后，利用EML4-ALK阳性小鼠同种移植瘤模型（mEA1）评估阿来替尼单药、阿来替尼联合MET抑制剂（capmatinib）、阿来替尼联合整合素抑制剂（cilengitide）及三药联合方案的体内抗肿瘤效果。主要评价指标包括肿瘤细胞活力（基于核荧光标记计数）、关键信号蛋白磷酸化水平（通过免疫印迹与流式细胞术检测）、移植瘤体积与重量变化，次要指标涵盖小鼠体重变化以评估治疗耐受性。此外，研究还利用临床数据库（OncoSG）分析了CAFs标志物FAP-α与ITGB1表达水平与肿瘤分期及患者生存的相关性。

研究首先发现，物理共培养介导的耐药强度显著高于单纯条件培养基处理。在接近临床血清峰浓度的阿来替尼（0.625μM）作用下，H3122细胞与MRC5成纤维细胞共培养后存活率提升至单培养组的3.2倍，而条件培养基处理仅提升至1.8倍，提示细胞接触依赖性信号不可或缺（图1）。通过80种细胞因子芯片筛选，研究者锁定CAFs分泌的核心因子为肝细胞生长因子（HGF），其浓度在条件培养基中达1.1-1.3 ng/mL。外源性HGF（1.3 ng/mL）可完全模拟条件培养基的耐药保护作用，而MET抑制剂capmatinib能彻底逆转该效应。然而，capmatinib对共培养介导的耐药仅部分有效（存活率从80%降至55%），证实存在MET非依赖的第二条耐药通路（图2）。

图1 成纤维细胞对EML4-ALK阳性非小细胞肺癌细胞药物敏感性的调节作用

图2 成纤维细胞分泌因子对EML4-ALK阳性非小细胞肺癌细胞TKI敏感性的影响

为无偏倚地解析第二条通路，研究团队采用CTAP蛋白质组学策略。结果显示，与单培养相比，共培养诱导的磷酸化信号变化幅度远超药物本身处理效应。在阿来替尼处理的H3122细胞中，CAFs接触显著降低EGFR（Tyr1172）激活磷酸化，但增强抑制性SRC（Tyr530）磷酸化，同时特异性激活CTTN、NES、ITGA5等黏附信号蛋白。激酶底物富集分析（KSEA）预测ROCK1/2、PAK1/2、PRKCA/E等黏附相关激酶活性上调，而RSK1/2/3、AKT1等促生存激酶亦被激活。表达蛋白质组学进一步揭示，CAFs促使肿瘤细胞内FN1、多种胶原及ITGA5、CAV1表达显著上调，这些蛋白的丰度变化较磷酸化修饰对信号传导的影响更为关键。整合数据表明，CAFs通过上调ECM-整合素信号轴，特别是ITGB1异二聚体（可与ITGA2、ITGA5形成异源二聚体），代偿性激活EML4-ALK下游的ERK/RSK与AKT/mTOR通路（图3）。

图3 EML4-ALK阳性非小细胞肺癌细胞与CAFs单培养及共培养中的磷酸化与表达蛋白质组学分析

功能验证环节，流式细胞术检测显示共培养使ITGB1激活水平提升2.4倍，而整合素拮抗剂cilengitide可将其恢复至单培养基线。在FN1包被的培养板上，H3122细胞对阿来替尼的敏感性下降50%，该效应被cilengitide完全消除。免疫印迹证实FN1通过激活FAK（Tyr397）磷酸化，进而恢复ERK、AKT及S6磷酸化，绕过ALK抑制（图4）。CRISPR-Cas9敲除ITGB1使共培养细胞的阿来替尼IC50值从1.2μM降至0.4μM，但未能完全消除耐药。当ITGB1敲除联合capmatinib处理时，共培养细胞的药物敏感性恢复至单培养水平。药理学实验复制了这一结果：cilengitide与capmatinib单用分别使共培养存活率降至68%和55%，而两药联用进一步降至25%，与单培养无统计学差异。值得注意的是，该联合策略在天然耐药的CUTO8与CUTO9细胞系中同样有效。

图4 靶向整合素信号对共培养介导的耐药性的影响

体内实验数据更具说服力。在mEA1同种移植瘤模型中，阿来替尼单药治疗4周后肿瘤体积为基线的60%，而阿来替尼+capmatinib+cilengitide三药联合组肿瘤体积降至基线的20%，相对单药组缩小67%（P＜0.0001）。免疫组化显示，单药阿来替尼治疗后肿瘤组织S6（Ser235/236）磷酸化阳性面积比例反而升高至45%，提示代偿性激活；联合cilengitide后降至28%，三药联合进一步降至12%（图5）。临床数据挖掘揭示，在EGFR/ALK/ROS1突变阳性NSCLC队列中，FAP-α高表达与III-IV期肿瘤显著相关（P=0.036），而ITGB1高表达患者生存概率降低42%（HR=1.73，P=0.027），证实CAFs密度与整合素信号通路具有明确的临床预后价值。

图6 ITGB1表达与靶向治疗在非小细胞肺癌肿瘤中的作用

本研究通过精巧的实验设计与创新的CTAP蛋白质组学技术，首次在单细胞分辨率层面系统阐明了CAFs介导EML4-ALK阳性NSCLC耐药的完整信号网络，突破性发现HGF-MET旁分泌轴与FN1-ITGB1近分泌轴的协同作用是耐药的核心机制。这一发现不仅解释了为何单独靶向MET或整合素仅能部分克服耐药的临床困惑，更提供了可立即转化的三药联合治疗方案。值得注意的是，该研究巧妙利用了部分ALK抑制剂（如lorlatinib、ceritinib）本身具有FAK/PYK2抑制活性的多靶点特性，提出可通过药物重定位策略实现"双通路阻断"而无需真正联用三种药物，为降低临床毒性风险提供了可行路径。

参考文献

HU Q, REMSING RIX L L, DESAI B, et al. Cancer-associated fibroblasts confer ALK inhibitor resistance in EML4-ALK–driven lung cancer by concurrent integrin and MET signaling[J]. Sci Signal, 2025, 18(1): eads7662.

编辑：白术

审核：薄荷

封面图源：CMT