通过轮廓识别和放射变换提高MultiFRET插件在纳米细胞研究中的效率 前言：随着人们对纳米细胞研究软件的效率要求不断提高，开发高通量工具也就成为了必经之路，在开发的早期阶段，科研人员采用了实时FRET分析的传统方法，主要原理是利用一对ImageJ宏（FRET-online 和 FRET-offline）进行研究，然而遗憾的是，这种方法存在着重大缺陷。 最主要的缺陷源于使用固定坐标来裁剪分束器通道，这些坐标是通过费时费力的手动方法建立的，由于分束器容易受到镜子方向的影响，因此它的可靠性也会随之变弱。 这样的现象经常导致 ROI 位置错误，使 FRET 比率从同一细胞的不同部分开始计算，有时甚至是从细胞周围的附近计算的，这种差异需要经常修改“宏”以确保准确性，所以说，这并非是一项所有系统都能有效执行的技术任务。 第二个重大缺陷与“宏”在 ImageJ 的主工作线程中执行，而不是在单独的线程上操作有关，这不仅使得 ImageJ 的功能以及 Micro-Manager 的功能，在 FRET-online 宏执行期间无法访问，而且还阻止了在此过程中生成的窗口重新定位，如果出现这种情况，会导致我们在宏运行时，尝试移动这些图形将导致系统崩溃和数据丢失。 最后一个重大缺陷是线上和线下阶段的分离，这种分离加剧了FRET分析法的缺陷产生，这种划分使研究人员的工作量将增加了一倍有余，人们往往需要捕获阶段，然后是分析阶段，最后是涉及 Excel、SPSS 或 Graphpad Prism 等软件的重新分析阶段。 这种具有离线和在线组件的分离工作流程，体现在使用 Clampex软件的早期实践中，这种分离增加了整个过程的复杂性和工作量。 为了纠正现有 ImageJ 基于宏的方法的缺点，我们在这次研究中需要开发新的MultiFRET插件，研究时，我发现了一个Icy 现代生物成像套件的存在，它是 ImageJ 的一个分支，拥有几个使其与旧工具区分开来的特殊功能。 值得注意的是，Icy 提供了一个基于 JDesktopPane 构建的用户界面，允许内部化窗口，这种设计方法解决了传统 ImageJ 工具经常遇到的窗口混乱问题，其中每个窗口都被视为用户界面中的单独实体。 除了窗口的简化，Icy 还提供了集成的 Micro-Manager (MM) 插件，允许MM在 Icy 环境中运行，这种集成增强了UI可见性，特别是当MM在其多维采集 (MDA) 过程中生成大量窗口时，这些窗口的内部化简化了整体用户体验。 重要的是，在 Icy 中与MM的集成释放了 Icy API 的潜力，其中包括强大的 EzPlug SDK，SDK工具包通过自动生成用于配置和执行插件的用户界面，来简化插件开发，不仅如此，EzPlug 还解决了线程问题，减轻了系统的复杂性。 虽然MM插件的最初开发使用了 EzPlug，但后来的迭代需要更大的接口灵活性，导致我们需要返工，MultiFRET 利用了 Icy API 中的其他功能，特别是与MM采集引擎的交互，引擎通过 IcyMM插件促进了对MM的控制，实现了读取位置列表、监听 MDA 捕获以及在实验完成时停止采集等功能。 在最初的迭代中，MultiFRET 提供了使用区域 (ROI) 勾画出相机输出中可见通道的轮廓，来提取相关通道的功能，这个插件采用边缘检测技术来创建紧密贴合的轮廓 ROI，这对于通道识别非常有价值。 尽管 Active Contours 最初是为细胞检测而设计的，但它可以配置为准确识别通道，然而，虽然这些轮廓被用于 Icy 的内置可视化工具包裁剪通道图像，但 MultiFRET 仅限于纠正位置、倾斜和尺寸差异，具有一定的局限性。 为了增强它的实用性，我们将高级校正功能集成到 MultiFRET 中，校正功能在每个通道上采用仿射变换来校正旋转，仿射变换也是投影变换，需要图像中的三个已知点来缩放、旋转、倾斜和扭曲图像。 在这种情况下，每个通道的角点被重新定位到图像视口上的相应位置，有效地消除了旋转和倾斜，虽然程序算法的执行时间大约为 10 秒，但它只需要运行一次即可提取角点坐标，随后的仿射变换可以在几微秒内执行，这种综合方法不仅解决了通道错位和旋转问题，还利用 Icy 及其集成MM插件的功能来增强整体实时 FRET 分析工作流程。 结论：我们在这次的研究中发现，早期实时FRET分析方法存在严重缺陷，如固定坐标裁剪通道、宏在主线程中执行等，为克服这些问题，我们开发了新的MultiFRET插件，利用现代生物成像套件Icy，集成Micro-Manager插件，通过EzPlug SDK实现界面自动生成和线程处理。
